概述

　　生命科学的发展，生物技术的进步使我们对疾病本质的认识不断地深入，也使我们拥有更多新的治疗方法和药物应对疾病的威胁。如何准确有效地利用这些新的治疗方法和药物治愈疾病是我们迫切需要研究的内容。如何对疾病进行正确的分型和诊断却是上述工作的基础。只有全面地把握病情，并在此基础上进行准确的判断和分析，才能为病患制定及时有效的治疗方案。因此我们要求疾病的诊断工作能提供更为准确和及时的结果。而古老的“望、闻、问、切”和传统的常规手段已远远无法满足我们对疾病诊断的要求，迫切需要将新的技术引入疾病诊断领域。

　　荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末，Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后，FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用，显示出与一些传统技术相比的明显优势。

　　与传统的免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的稳定性和可重复性。目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大（例如酸、碱和变性剂），检测条件的稳定性对检测结果至关重要。此外，免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断，对于一些弱阳性的结果，不同的检测者容易产生分歧。上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。荧光原位杂交技术检测的对象是细胞中的DNA，致密的双螺旋结构使DNA可以历经千百万年而依然保持良好，其结构稳定，不易被环境条件影响，为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。此外，荧光原位杂交结果的判定借助于对荧光的颜色判断和信号计数，客观地量化了检测地结果。如果借助于相应的FISH操作系统（例如Abbott-Vysis公司的Hybrit杂交仪和VP2000样本预处理系统）和染色体成像系统（例如AI公司的CytoVision）就能实现整个FISH操作的自动化，最大限度的降低操作者和检测者的主观因素，确保结果的准确性。

　　PCR由于灵敏度高，操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术，但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高，对同一样本也只能作一次分析，不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展，FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水平，并能很好弥补PCR技术的局限。FISH技术不仅有极低的假阳性、假阴性的比例（以Abbott-Vysis的产前诊断探针为例，29,000例的使用结果证实正确率高达99.9％），还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常，大大节省了检测的时间。此外，通过FISH可以对染色体或特定基因的数目异常，特定片断的缺失、易位和重排进行诊断研究。荧光原位杂交技术目前已经广泛应用在产前及植入前、肿瘤的预前和预后以及血液类疾病的诊断分型领域。

HER-2对乳腺癌的意义

　　HER-2是一种原癌基因,该基因编码一种跨膜糖蛋白HER-2,参与调控细胞的生长、增殖及分化,是公认的重要肿瘤分子标志之一,其过度表达是多种恶性肿瘤的的表型,由于在20%~30%的乳腺癌中具有HER-2 基因的异常扩增和蛋白的过度表达，因此现在也被广泛用于乳腺癌的预后评价及指导治疗。2005年版本的St Gallen指南指出：HER-2是有别于肿瘤大小、淋巴结及激素受体以外的重要预后因子，Slamon等也认为,除了淋巴结转移情况这一因素外,HER-2是乳腺癌预后评价中最有价值的分子标志。

　　Herceptin(贺赛汀)是一种针对HER-2/neu原癌基因产物的人/鼠嵌合单抗，能特异地作用于HER-2受体过度表达的乳腺癌细胞。1998年被美国FDA批准上市，无论单药还是与化疗药物合用治疗HER-2/neu过度表达的乳腺癌均取得了明显疗效。作用机制包括介导对过度表达HER-2/neu肿瘤细胞的CDC、ADCC等机制来抑制肿瘤生长；抑制HER-2/neu蛋白与RTK超家族的其它成员发生交联形成异质二聚体，减弱细胞生长信号的传递；介导HER-2/neu受体的内吞降解以减少其细胞表面密度，抑制肿瘤的进一步生长；通过诱导P27kipi和RB相关蛋白p130，大量减少S期细胞数目；下调细胞表面的HER-2/neu蛋白；减少血管内皮生长因子的产生。

　　NCCN治疗指南也指出了HER-2检测用于指导曲妥珠单抗（Herceptin，针对HER-2 蛋白的靶向单克隆抗体药物）治疗的重要性：HER-2阳性（淋巴结阳性或淋巴结阴性，肿瘤≧1cm）的乳腺癌病人都需要考虑含Herceptin的辅助治疗方案；Herceptin可以在AC序贯紫杉醇的辅助治疗方案中与紫杉醇联合使用或在辅助化疗完成后序贯使用。基于HER-2在乳腺癌诊断及治疗中重要的指导意义，采用最准确、合理的方法来检测乳腺癌细胞HER-2就尤为重要了。

(摘自乳腺癌实践指南2007)

乳腺癌的生物靶向诊断方法

　　目前经FDA批准，乳腺癌细胞HER-2的检测方法仅有两种：免疫组织化学（Immunohist℃hemistry，IHC）法测定HER-2蛋白过表达(HERceptest/Dako)；荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization ，FISH）法定量检测HER-2基因扩增，后者一直被认为是HER-2诊断的金标准。另外，一种新的检测HER-2过度表达的方法—色素原位杂交法（Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization，CISH）也得到了一定的认识和应用，并且显示与标准IHC法和FISH法结果有较高的一致性。

　　IHC是一种广泛应用的检测方法，它是通过特异性抗体检测细胞内及细胞表面的蛋白，FISH和CISH是在近几年开始被应用的检测方法，它们是一种在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。

　　1. IHC法

　　IHC的实验流程主要是以下几个步骤：封闭、滴加抗体、显色三大步骤。一般的病理实验室均有条件进行操作。

IHC的判定标准是

级　别	结　果
0/1+	阴性
2+	弱阳性
3+	阳性

　　以FISH结果作为参比标准的话，针对IHC的准确性和敏感性，不同的实验室得出了相似的结论：IHC结果为3+时，FISH阳性率为91.7% ；IHC结果为2+时，FISH阳性率为23.3% ；IHC结果为1+和0时，FISH阳性率分别为7.4%和4.1% 。

　　以上结果显示IHC法在结果为1+和0+时，使用FISH方法有一定的阳性率，但是p<0.001，这表明FISH和IHC的一致性仍然是很好的，如果IHC结果为0或者1+，可以酌情应用FISH作检测；当IHC结果为2+时，一致性为23-25%，这时需要应用FISH法进行进一步的检测；3+的样本中准确率与FISH方法的一致性较高，可以直接作为诊断依据。

　　2. CISH法

　　CISH（色素原位杂交法，Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization）作为一种新的检测HER-2过度表达的方法逐步得到应用，它的原理是首先将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使实验者在光学显微镜下检测福尔马林固定的石蜡包埋的组织、染色体中期分裂和固定的细胞。CISH的操作流程和FISH相似，先要进行杂交前预处理（蛋白酶消化等），然后进行杂交反应（滴加杂交液，变性，孵育杂交）、最后一步杂交后处理（洗涤封闭，免疫组化信号放大、显色）相对FISH法要繁琐一些。

　　它的主要优点是: 可以以组织切片的方式储藏；能做组织学评价；用普通光学显微镜进行结果观察。研究发现，在使用FDA认证的PathVysion检测结果作为为金标准时，CISH和FISH在IHC为3+时有较高的一致性；IHC为2+时CISH的敏感度与FISH相比有了一定的差异；IHC为1+和0+时CISH与FISH的差异更为明显。总体来说，CISH的正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。

　　IHC、FISH和CISH这三种方法各有利弊，在选择最合适的方法进行乳腺癌诊断时，应针对三种方法的不同特点进行选择。

　　IHC法阴性结果的诊断准确率是很高的，如果样本是0/1+，那么可以根据患者实际情况判定是否需要进行进一步的检测。如果结果为3+，那么一般认为是HER-2阳性，可以按照NCCN指南进行治疗。对于检测结果为2+的样本，则需要进行基因水平的检测。

　　FISH法结果准确，大多数欧美病理检测中心以此为标准，尤其是使用FDA认证的Abbott-Vysis—PathVysion试剂盒判定的检测结果。FISH法在低倍、高倍扩增及非整倍染色体检测中都显示了极高的灵敏度和准确性，同时FISH法对于判定冰冻切片样本和石蜡切片样本时有同等的准确性，开阔了样本的适用范围。对于价格问题，选择合适的检测形式，整体的诊断费用是可以作为必备的检测方法接收的。

　　CISH法操作与FISH有一定的相似之处，与FISH有较好的一致性：正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。应该注意的是CISH对于低倍扩增（6-10个扩增/cell）检测的灵敏度明显下降，对于有非整倍体染色体的样本，同样会有假阴性的检测结果。检测结果为酶学“阳性簇”，阳性信号无法准确计数。基于以上原因不建议使用CISH作为IHC结果为0/1+/2+样本HER-2阳性确诊的方法，在这种情况下我们建议使用FISH方法检测结果作为确诊依据。

非小细胞肺癌的EGFR、HER-2高拷贝数FISH检测

　　表皮生长因子受体，特别是EGFR和HER-2的过表达或调节异常与肺癌的发生发展密切相关。但来自不同研究组的关于EGFR过表达率(43％～89％)和HER-2过表达率(5％～50％)的数据差别极大，而且EGFR和HER-2过表达与肺癌预后、生存期以及靶向药物治疗敏感性的关系等研究结论也存在着较大的差异，人们对EGFR和HER-2蛋白过表达的生物学意义和临床意义仍存在着相当大的争议。分析者认为可能与不同的操作程序、检测方法(免疫组织化学、mRNA等)、试剂(抗体等)以及评分标准不统一等诸多因素有关。除此之外，与乳腺癌HER-2基因扩增和HER-2蛋白过表达的相关性不同的是，相对于具有较高蛋白过表达率的EGFR和HER-2来说，肺癌中EGFR和HER-2基因扩增频率却非常低(分别为9％和2％)，即EGFR和HER-2基因扩增和相应的蛋白过表达无正相关关系。有学者认为，与基因扩增和蛋白过表达相比，EGFR或HER-2基因拷贝数增加是更有效的临床评价指标。Hirsch等认为高EGFR基因拷贝数是引起EGFR蛋白过表达并具有不良预后的原因，而Nakamura等认为HER-2基因拷贝数与其蛋白的过表达及疾病预后无关；Hirsch等的研究显示可以用EGFR基因拷贝数筛选EGFR抑制剂的敏感人群，而Cappuzzo等则认为应该以HER-2基因拷贝数来筛选。

多赢医学研究中心可以做到标准的实验室操作流程，避免操作程序、检测方法、试剂等的因素。

标本要求

　　病理切片：浸润性乳腺癌或乳腺癌的浸润性部分；组织处理的条件必须标准化，固定液为10%中性缓冲福尔马林，固定时间是6-48小时，并且上述条件需在病理报告中标注；4-6μm切片最佳（适用于乳腺癌、肺癌等）。

送检流程

　　手术或针吸刺取材（原发癌灶或转移淋巴结）→10%中性缓冲福尔马林固定（时间是6-48小时）→切片（4-6μm切片最佳）→送检至多赢实验中心→FISH→1周内发报告