三、ATP-肿瘤药敏检测技术的应用 　　1、适用的肿瘤标本类型                 　　实体瘤标本 　　胸腹水 　　活检淋巴结 　　2、本试剂的主要用途 　　⑴ 筛选患者肿瘤细胞对化疗药物的敏感谱，设计个案化治疗方案； 　　⑵ 研究和确定新的化疗方案和治疗原则； 　　⑶ 评估联合用药方案的合理性； 　　⑷ 化疗药物新适应症研究。 四、开展ATP-肿瘤药敏检测的技术条件和检测方法 （一）技术条件 　　1、实验室和仪器设备    20～40平方米的实验室，超净工作台，发光分析仪，CO2细胞培养箱，离心机，倒置显微镜，电脑，以及组织培养所需的血细胞计数板，多道加样器等常规组织培养技术所需技术条件。 　　2、人员   具备组织培养和微机操作经验的技师2人。 　　3、所需经费   大约20～30万元。如果在组织培养实验室的基础上开展本项目仅需添置发光分析仪，约20万元。 （二）检测方法 　　1、操作步骤： 　　⑴ 标本的处理和运送: 　　① 实体瘤标本的处理、运送 　　为了获得足够数量活的肿瘤细胞，要切取血供丰富的肿瘤细胞较多、未坏死液化的瘤组织标本不小于1.0克。取出标本后应立即浸入RPM11640溶液中,并在最短时间内（3小时内）送抵实验室。用PBS清洗其表面，将标本置于标本浸泡液中浸泡15分钟。 　　② 胸腹水标本的处理、运送 因胸腹水中细胞数量多少不一，应尽量多收集标本，不少于500ml，按 20u/ml的浓度加入肝素抗凝。 　　⑵ 肿瘤细胞悬液的制备 　　① 实体瘤 　　A、组织消化液配制：将10ml培养基加入到组织消化酶冻干瓶中充分混合溶解，吸出置于50ml无菌塑料离心管中待用。 　　B、除去标本浸泡液，剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪，用无菌剪刀将标本剪碎成1mm的碎块，然后将其转移至含组织消化液的离心管中。 　　C、将离心管倾斜置于37℃孵育箱中孵育1.5～3小时，每隔15～30分钟振摇一次,使其充分消化。 　　D、将消化好的混合液通过细胞筛,如果团块较多，可以用注射器芯轻轻研磨，以辅助细胞分散。 　　E、洗涤细胞。 加入25ml培养基，混匀后400g离心10分钟，去上清。如红细胞 >25%时应去除红细胞。然后加入25ml培养基混悬沉淀物，400g离心8～10分钟，去上清。加入3～5ml培养基混匀，制备成细胞悬液。    　　F、细胞计数。 吸取一定量的细胞悬液，适当稀释后台盼蓝染色计数，包括不含红细胞的各类细胞总数、大细胞数、细胞存活比率。 　　② 胸腹水标本的制备 　　A、将肝素抗凝的胸腹水标本， 400g离心10分钟，弃上清。 如有大量红细胞 （>25%），去除。加入20ml培养基混悬沉淀物，400g离心8～10 分钟，去上清，加入3～5ml培养基混匀制备得细胞悬液。 　　B、细胞计数。 　　方法同上。 　　C、培养肿瘤细胞系 　　C-1、贴壁细胞。用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化细胞，收集后用20ml培养基400g离心10分钟，弃上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。 　　C-2、悬浮细胞。400g离心10分钟，去上清，用3ml培养基混匀细胞，计数后备用。 　　⑶、去除红细胞 　　（注：此操作的前提是有足够的细胞可用） 　　第一次离心后，去除上清，加入预冷的10ml红细胞裂解液，使细胞悬浮，冰浴5分钟后加入20ml培养基，200g离心8-10分钟，去上清。红细胞较多的胸腹水标本，冰浴时间延长15-20分钟，并轻摇两次。 　　⑷、加药步骤 　　①、准备待测化疗药物 根据待测药物的临床使用剂量及其所对应的血浆峰值浓度，设定6个检测浓度,即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的PPC。每个浓度作2个平行孔。同时设定M0：ATP最大吸收孔，Mi：100%活细胞抑制孔。 　　A、用培养基（建议10ml）来配制800％PPC的待测药物。 　　B、用多道加样器，向每个检测孔和G1-G12孔（M 0 ）中加入0.1ml培养基。 　　C、用多道加样器，在H1-H12孔中加入0.1ml ATP生成抑制剂，即M i 孔（进行下一步前请更换吸头）。 　　D、用可调加样器，向A行孔中加入0.1ml 800％PPC的待测药物。 　　E、用多道加样器，从A→F行倍比（2×）稀释药液，最后的0.1ml弃去。这样从A行到F行，药物的浓度是400％-12.5％PPC。 　　②、细胞接种和培养 　　一般情况下，细胞接种数量在2～4万/孔之间可以得到比较好的试验结果。细胞接种数量和接种时大细胞（大多数单核细胞）所占的比例有重要关系。 　　A、计数后，确定接种细胞量。用培养基稀释至细胞密度为20～40万/ml。 　　B、用多道加样枪，从A行到F行，每孔加入0.1ml的细胞悬液,这样，从A行到F行每孔的细胞数为2～4万个,而药物浓度为200％～6.25％PPC。 　　C、加完细胞悬液后更换加样枪头，用多道加样器，将A1到F1，A2到F2A3到F3孔的药液充分混合，更换加样枪头，将A4到F4，A5到F5，A6到F6孔中的药液充分混合，依次类推到A12和F12孔。（此步注意交叉污染） 　　D、在G行，M0对照孔用多道加样器每孔加入0.1ml细胞悬液。 　　E、在H行，MI对照孔用多道加样器每孔加入0.1ml细胞悬液。 　　F、将培养板放置在湿盒内，置于37℃，5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养5～7天（注意：培养期间保持孵箱内湿度大于95％）。 　　⑸ 肿瘤细胞生长状态观察 　　肿瘤细胞接种以后在孵箱中培养5～7天。在此期间应该对肿瘤细胞生长状态进行观察，以便及时了解细胞培养情况，如有无细菌或真菌污染，接种是否均匀，肿瘤细胞是否贴壁和伸展，以及其克隆生成情况。隔天观察一次为宜。  　　⑹ ATP的提取及荧光测定 　　完成5～7天培养后，即可提取细胞ATP进行测定。 　　① ATP的提取 　　A、配制荧光酶-荧光素系统工作液。 将12ml荧光酶工作液加入到荧光酶-荧光素系统中，充分溶解混合配成发光工作液，室温避光放置10分钟。 　　B、用多道加样器自A-G，H(换枪头)行顺序将ATP提取液加入96孔培养板， 每孔加入 50ul，室温静置5分钟，等待测定。 　　② 荧光测定 　　A、完成ATP提取以后，用多道加样器自96孔培养板A～G，H顺序依次吸出 50ul上清液，对应加入到荧光测定板中。 　　C、在荧光测定板中每孔加入50ul发光工作液， 在微量振荡器上振荡10秒钟，立刻用发光分析仪测定。 　　⑺ ATP标准曲线绘制 　　① 每次实验都需绘制ATP标准曲线来定量评估待测细胞ATP的含量。 　　② 向ATP冻干瓶内加入无菌去离子水2ml，充分溶解，溶液浓度为250ng/ml。 　　③ 系列稀释ATP溶液，ATP含量依次为：250、83.3、27.4、9.1、3.0、1、0.33、0.11ng/ml加入配好的发光工作液，每个浓度取50ul，设2个平行孔即刻进行测量。 　　④ 以每个梯度平均荧光值为纵坐标，ATP含量对数值为横坐标做标准曲线，计算相关系数和变异系数。 　　2、自动数据传输和分析 　　检测的数据传输到计算机并自动生成EXCEL表格形式文件。该表格已经预设定好了公式，用来计算每种药物每个浓度的肿瘤生长抑制率，绘制抑制曲线图。将药物相对百分比浓度和相应抑制率输入SPSS软件包进行分析，计算各药物的IC 50 和IC 90 。 　　3、评价标准    　　以下是肿瘤对化疗药物敏感性的评价标准。  　　高度敏感：IC 50 <25%PPC及IC 90 <100%PPC 　　中度敏感：IC 50 <25%PPC及IC 90 >100%PPC 　　轻度敏感：IC 50 >25%PPC及IC 90 <100%PPC 　　耐药：IC 50 >25%PPC及IC 90 >100%PPC 　　说明： 　　IC 90 ：抑制90%肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比 　　IC 50 ：抑制50%肿瘤生长时的血浆峰值浓度百分比 　　PPC：一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度 五、产品实物照片 　　试剂盒组成: 　　① 组织消化酶 ×2 瓶/冻干 　　② ATP提取液 ×1瓶/25ml 　　③ 96孔培养板×4 块 　　④ 荧光酶-荧光素系统×2瓶/冻干 　　⑤ 培养基 ×1 瓶/200ml 　　⑥ ATP生成抑制剂 ×1瓶/10ml 　　⑦ 红细胞裂解液 ×1瓶/25ml 　　⑧ 荧光酶工作液 ×1瓶/25ml 　　⑨ ATP标准 ×1瓶/冻干 　　⑩ 说明书  1份

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